人肿瘤坏死因子α ELISA试剂盒说明书（二） 
上海原鑫生物科技从事科研试剂的优质企业。该文章详细的介绍了人肿瘤坏死因子α ELISA试剂盒的样本收集及储存、试剂准备、检测步骤、结果判断、参数表征和常见问题及解决方法这六个方面。本文仅供于科研研究，不得用于临床试验！
一、样本收集及储存
1. 细胞培养上清： 将细胞培养基移至无菌离心管，在 4℃条件下1000 ×g 离心10 min,然后将上清等量分装于小 EP 管并 于-20℃下保存（24 小时内检测可放入 2-8℃储存），避免反复冻融。 2. 血清样本： 室温血液自然凝固 20 min 后，在 4℃条件下 1000×g 离心 10 min，然后将上清等量分装于小EP管并于-20℃下保存（24 小时内检测可放入2-8℃储存），保存过程中如有沉淀，请再次离心，避免反复冻融。 3. 血浆样本： 将全血收集到含抗血凝剂的管中，根据标本的实际要求选择 EDTA，柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混 合 20 min，在 4℃条件下 1000×g 离心 10 min，然后将上清等量分装于小 EP 管并于-20℃下保存（24 小时内检测可放入 2-8℃储存），避免反复冻融。 注意事项：血清血浆样本避免使用溶血、高血脂样本，以免影响检测结果；如果样本中的靶标物检测浓度高 于标准品的最高值，请将样品做适当倍数稀释后检测，建议正式实验前做预实验以确定稀释倍数。
二、试剂准备
1. 试剂回温：首先在实验前 30 min 将试剂盒，待测样本放置于室温下复温。 2. 配制洗涤液：预先计算好稀释后的洗涤液使用体积，然后用超纯水或去离子水将 20 倍浓缩洗涤液稀释 成 1 倍应用液，未用完的浓缩洗涤液放入 4℃冰箱保存。 3. 标准品梯度稀释：在标准品中加入1ml标准品稀释液至完全溶解，按照浓度为2500pg/ml、1250pg/ml、625pg/ml、312.5pg/ml、156.25pg/ml、78.13pg/ml、39.06pg/ml进行等比稀释，具体操作如下图所示。
三、检测步骤
1. 按照实验设计，在标准品与样本孔中加样100ul，空白对照不加 2. 25℃避光孵育2h 3. 弃去液体，用洗涤液清洗4次，每次每孔至少加洗涤液300ul，洗完后吸水纸上拍干 4. 加入酶标抗体溶液100ul，空白对照不加，25℃避光孵育1h 5. 同步骤3 6. 每孔加入底物A、B各50ul，25℃避光孵育20min，显色浅可适当延长孵育时间 7. 加入终止液50ul，10min内在450nm波长处测OD值
四、结果判断
1. 用酶标仪 450 nm 波长测定 OD 值。 2. 计算标准品、样品的平均 OD 值：每个标准品和标本的 OD 值应减去零孔的 OD 值 3. 以标准品浓度为横坐标，吸光度OD值为纵坐标，用软件绘制标准曲线，样品中TNFA含量可通过对应OD 值由标准曲线换算出相应的浓度。 若标本 OD 值高于标准曲线上限，应做适当稀释后重新检测，计算浓度时再乘以稀释倍数
五、参数表征
1.数据及标准曲线
2. 准确度：标准品线性回归与预期浓度相关系数R>0.95 3. 检测范围：39.06-2500pg/ml(如超出检测范围，需将样本稀释后检测) 4. 灵敏度：≤39.06pg/ml 4 特异性：不与其他可溶性结构类似物交叉反应 5 重复性：变异系数≤15% 6 储存条件：2-8℃冷藏 7 有效期：6个月
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