谷胱甘肽过氧化物酶（GPx)活性检测试剂盒改进说明书 
1. 谷胱甘肽过氧化物酶活性检测试剂盒简介 谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase，GPx）是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶，可以清除活细胞内的过氧化物，保护细胞免受自由基损伤。GPx催化还原型谷胱甘肽(GSH)还原H2O2和多种有机过氧化物，从而消除活性氧的毒害作用。
2. GPx活性测定受到粗酶液中过氧化氢酶的干扰
GPx可以催化2 GSH氧化生成1 GSSG，而谷胱甘肽还原酶可以利用NADPH催化1 GSSG产生2 GSH，其中GPx是限速酶。因此，通过检测NADPH的减少速率即可计算GPx活性。H2O2是最常见的过氧化物，以往科铭的试剂盒也是采用了H2O2作为底物。
但是底物H2O2也可以被粗酶液中普遍存在的过氧化氢酶(Catalase)催化分解，干扰GPx活性测定。在样本中CAT活性不高的情况下，这种干扰不会对测定产生显著影响。但当遇到肝脏等CAT活性较高的样本时，会极大干扰GPx测定。
3. GPx测定方法的改进思路
要避免CAT干扰，主要有两种思路。一种是去除或抑制CAT的活性，另一种是选择不受CAT催化反应的底物。常见的CAT抑制剂有叠氮化钠等。但是叠氮化钠属于危险化学品。
GPx可以催化还原多种有机过氧化物，而CAT则不会与有机过氧化物发生反应。参考了文献报道，并进行实验验证后，我们选用了叔丁基过氧化氢作为底物。叔丁基过氧化氢不会与GSH发生自发性反应，也不会被CAT催化分解。同时，叔丁基过氧化氢不会被不含硒的谷胱甘肽过氧化物酶催化，因此可以特异性的检测最常见的含硒的GPx活性。
4. 改进后谷胱甘肽过氧化物酶活性测定试剂盒的优势
4.1 适用于不同类型的样本
可测定动植物组织、血清等（图1）。 
图1:不同样本GPx吸光值差值对比
4.2 受到CAT干扰更小，反应稳定性更好
图2显示，在CAT的干扰下，吸光值出现无规律的剧烈波动，这是因为CAT消耗了底物，同时产生大量气泡，极大干扰了测定。 
图2:改进前的小鼠肝脏样本10分钟内吸光值变化 
图3显示，改进后，CAT的干扰被排除，吸光值稳定下降，并最终耗尽底物进入平台期。
5. GPx活性检测试剂盒改进体会 酶活性测定中，除了要保证测定原理可靠外，更要注意干扰物质的影响。在谷胱甘肽过氧化物酶活性测定试剂盒中，我们通过谷胱甘肽还原酶间接测定GPx活性，屏蔽了一部分干扰。而在此次改进中，我们使用特异性更强的底物，将底物可能产生的干扰也降到最低，才保证了测定结果的稳定可靠。 这次改进的过程中我认识到，必须从源头开始，利用底物、酶、反应原理的特异性，逐步排除干扰，才能得到真正可靠的试剂盒。
科铭试剂盒都是自主研发的，经过了各种各样生物样本实际测定的检验，并且根据试剂盒用户的反馈和我司代测员工的报告，对试剂盒加以改进，以确保试剂盒的质量。此外，原鑫生物特别强调并且协助用户做好预实验和预测定，必要时科铭对用户测定结果进行验证，以保证样本质量可靠和测定结果真实。
文章来源：http://www.shyx-bio.com/newss-164.html
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