人抗中性粒细胞胞浆抗体(cANCA)ELISA Kit试剂盒/测试盒

人抗中性粒细胞胞浆抗体(cANCA)ELISA Kit

详细信息

货号：YX-130913

品牌： 原鑫生物

供应商：上海原鑫生物科技有限公司

检测限： /

检测方法： 酶联免疫法双抗夹心法

应用： ELISA

适应物种： 人/动物/植物

样本： 血清、血浆、尿液、细胞培养上清、组织液等

规格： 96T/48T

【实验原理】

用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗该指标抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗该指标抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的该指标呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

试剂盒组成及试剂配制

1、酶联板：一块（96孔；48孔）

2、标准品：2瓶

3、样品稀释液：1×20ml/瓶

4、生物素标记抗体稀释液：1×10ml/瓶

5、辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液：1×10ml/瓶

6、生物素标记抗体：1×120μl/瓶（1：100）

7、辣根过氧化物酶标记亲和素：1×120μl/瓶（1：100）

8、底物溶液：1×10ml/瓶

9、浓洗涤液：1×20ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。

10、终止液：1×10ml/瓶

【实验材料与试剂配制】

1、仪器与材料：酶标仪（使用前预热30分钟），微量加液器、吸头、蒸馏水或去离子水，滤纸。

2、洗液的配制：按比例配制洗液备用。

【样品收集、处理及保存】

1、细胞培养上清：

适用于检测体外培养的细胞分泌性成份。用无菌管收集细胞上清液，以1000×g离心15分钟，收集上清。

2、细胞：

用PBS反复洗涤细胞3次，调整细胞浓度达到104-106/ml 左右，通过反复冻融，使细胞破坏并放出细胞内成份，或者细胞超声粉碎，离心取上清液检测。

3、血清：

在室温下，血液自然凝固，以1000×g离心15分钟，取上清待测。

4、血浆：

应根据标本的要求选择EDTA 或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合后静置10-20分钟后，以1000×g离心15分钟，收集上清。

5、体液：

包括胸腹水、脑脊液，分泌物等。使用不含热原和内毒素的离心管收集，以1000×g离心15分钟，收集上清。

6、组织标本：

切取组织标本，称取重量0.5mg，加入500ul 的PBS，用手工或匀浆器，或超声破碎仪将标本匀浆，以2000-3000rmp离心20分钟，收集上清进行检测。

样品中不能含有NaN3，因NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

7、保存：

如果样品不能立即检测，应将其分装，-70℃保存，避免反复冷冻。保存过程中如出现沉淀，应再次离心。血液标本尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中含大量颗粒，检测前先离心或过滤。不要在37℃或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

【操作步骤】

1、取出试剂盒，室温（20-25℃）放置30分钟。

2、分组：取出96孔板，根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数，把剩余的板条继续冷藏处理。10个标准孔，1个空白对照

3、标准品的稀释：准备小试管6只，依次编好号码，先在各小试管中加入标准品稀释液100ul，然后取原浓度标准品100ul 加入一只已编好号的试管中，充分混匀;再在该试管中取100ul 加入第二支试管中，充分混匀；再在该试管中取100ul 加入第三只试管中，充分混匀；再在该试管中取100ul 加入第四只试管中，充分混匀；再在该试管中取100ul 加入第五只试管中，充分混匀；然后在该试管中取100ul，弃掉。第六只试管作为0 号标准品。

4、加样：依照标准品的顺序分别加入50ul的标准品溶液于空白微孔中；空白对照孔加入50ul的蒸馏水；其余微孔中先加样品40ul然后再加生物素标记的抗体10ul。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

5、温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

6、洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒弃去，如此重复5次，拍干。

7、加酶标溶液：标准品组、待测样本组各孔中加入50ul的酶标溶液（空白对照孔除外）。

8、温育：酶标板用封板纸密封后，放入湿盒内于37℃恒温孵育1小时。

9、洗板：用稀释后的洗涤液注满每孔，静置15-30s，充分清洗酶标板5次，用吸水纸彻底拍干。

10、显色：各孔加入显色剂A液50ul后，再加入显色剂B液50ul。

11、终止：25-37℃下避光反应10-15分钟，加入50ul终止液。

12、读板：在450nm波长读取各孔的OD值。

注：读板时必须拭干板底残留的液体和手指痕迹，读板时间控制在终止反应后的30分钟内，以免影响准确性。

【数据计算】

以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，即为样品的实际浓度。

六．注意事项：

1）实验操作中必须使用一次性吸头，避免交叉污染。

2）加样：加样时，要控制加样速度，避免第一孔与*一孔间的时间间隔过大，否则将会导致不同的预孵育时间，从而影响实验的准确性以及重复性。

3）孵育：严格按照说明书上规定的孵育时间和温度进行。

反应时间的控制：加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化，如果颜色较深，请提前加入终止液终止反应。

4）建议实验前预测样品含量，如样品浓度过高，应对样品进行稀释，计算结果时乘以相应的稀释倍数。

5）建议使用本试剂盒时先做预实验（即先做标准曲线，试用几个标本），如果对本试剂盒有任何疑问，可和所购经销商联系，如果因运输过程导致试剂盒失效，可要求调换，但概不承担产品本身以外的任何损失。

研发、生产科研产品：

ELISA试剂盒：多种属、1000多种指标：人、大小鼠、通用、牛、兔、山羊、仓鼠、猪、马、鸡、犬、豚鼠、猴、绵羊
抗体：兔多抗、鼠单抗种类丰富，一抗1万余种，二抗100多种；
重组蛋白：多项发明专利，原核表达系统稳定表达蛋白1000余种。

在线联系：（周经理） 17621047120 QQ：2441609688（任经理）
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