小鼠溴脱氧核苷尿嘧啶试剂盒 BrdUelisa试剂盒

维生素D需经过两步的酶促反应(25-羟基化作用和1α-羟基化作用),才能产生有活性的1α,25(OH)2D.其中,CYP2R1是生物体内催化维生素D的25-羟基化作用的关键酶,该过程是活性维生素D合成的重要环节.目前,国内外对小鼠CYP2R1的认识还非常有限,其蛋白结构,理化性质和病理学功能等也尚不清楚.此外,随着维生素D缺乏症的发生,维生素D的需求量增加,其生物学转化也具有广阔的应用前景,因此,维生素D 25-羟基化酶CYP2R1的相关研究显得尤为重要.本研究首先利用生物信息学软件对小鼠CYP2R1序列进行分析,为小鼠CYP2R1理化性质的研究及其定向改造提供参考;其次,克隆小鼠CYP2R1基因并在宫颈癌(Hela)细胞中进行表达,以构建真核高表达载体,为活性维生素D的生物学转化提供实验基础;此外,通过细胞划痕实验,MTT检测和qPCR检测,初步探讨小鼠CYP2R1对Hela细胞增殖的影响。

为小鼠CYP2R1的相关功能研究提供了实验基础.主要结Arg131,Arg138,Lys434,Lys435,Arg445,Arg455.以结构明确的人CYP2R1为标准,比较了11个物种CYP2R1的二级结构;并以人CYP2R1结构为模板,对小鼠CYP2R1进行了同源建模,比较了小鼠CYP2R1与人CYP2R1三级结构的差异.(2)利用融合有His标签的pcDNA3.1(+)构建了小鼠CYP2R1真核表达载体pcDNA3.1-CYP2R1,该载体能有效提高CYP2R1的mRNA和蛋白表达水平,其中mRNA水平提高了82524.59倍.(3)小鼠CYP2R1能够同时上调细胞周期调控因子CyclinD1,P27和P21基因的表达,其中重组质粒转染组的CyclinD1和P27的相对表达量相比空载质粒转染组具有极显著差异(p0.01).推测CYP2R1参与了CyclinD1和P27对细胞周期的调控,但可能形成反馈调节系统CyclinD1-CDK-P27,导致Hela细胞的增殖变化不明显。

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