以下是原鑫生物整理的短链脂肪酸ELISA试剂盒的完整使用指南，整合操作流程、样本处理、结果计算及关键注意事项。
一、试剂盒组成与原理
1. 核心组分（依据）：
预包被96孔酶标板（短链脂肪酸特异性抗体）
冻干标准品（浓度梯度）
生物素标记抗体工作液
酶标记物工作液（HRP链霉亲和素）
TMB显色底物（A/B液需1:1混合）
终止液（2M硫酸，具腐蚀性）
30×浓缩洗涤液（需稀释至25倍）
样本稀释液
> 检测原理：双抗体夹心法。样本中短链脂肪酸与包被抗体结合，再与酶标记物形成复合物，催化底物显色，OD450nm值与浓度正相关。
二、样本处理规范
关键步骤：
| 样本类型 | 处理步骤 | 保存条件
| 血清 | 全血室温静置2h或4℃过夜 → 1000×g离心20min取上清 | 20℃（≤6个月）或80℃（≤2年）
| 血浆 | 推荐EDTA抗凝 → 采血30min内4℃、1000×g离心15min | 同血清
| 组织匀浆 | 1. PBS洗涤 → 称重；<br>2. 冰上裂解（1g组织+9ml裂解液）→ 超声/冻融破碎；<br>3. 500010000×g离心10min取上清；<br>4. 测总蛋白（BCA法），调至13mg/ml | 同血清
| 细胞上清 | 2500rpm离心5min取澄清上清 | 80℃冻存
| 粪便 | 新鲜采集或80℃保存，稀释后离心取上清（需预实验验证） | 80℃
> 裂解液选择：
> 避免含NP40、Triton X100、DTT的RIPA（抑制反应）；
> 推荐50mM Tris + 0.9% NaCl + 0.1% SDS (pH7.3) 。
> 特殊处理：肝脏/肾脏/胰腺样本需1% H₂O₂灭活15min（防内源性过氧化物酶假阳性）。
三、操作流程
1. 试剂准备
洗涤液：30ml浓缩液 + 720ml超纯水 → 稀释25倍（若结晶需40℃水浴溶解）。
标准品梯度稀释：
复溶：1ml样品稀释液溶解冻干标准品 → 涡旋混匀 → 1000×g离心1min ；
稀释：取7管各加300μl稀释液 → 按1:2等比稀释（如300μl原液→1/2管→混匀→取300μl→1/4管…）。
生物素抗体工作液：按1:100现配（10μl浓缩液 + 990μl抗体稀释液）。
2. 检测步骤
| 顺序 | 操作 | 参数
| 预洗 | 酶标板加洗涤液 → 静置30s → 弃液（重复2次） | 拍干残留液
| 加样 | 标准品/样本各50μl → 立即加50μl生物素抗体 | 更换吸头，混匀1min
| 孵育1 | 覆膜 → 37℃孵育45min → 洗板3次 | 每次浸泡1min
| 加酶 | 每孔加100μl酶标物工作液 → 覆膜 → 37℃孵育30min | 洗板5次
| 显色 | 加90μl TMB底物 → 37℃避光显色1020min（密切监控） | 显蓝色梯度
| 终止 | 加50μl终止液 → 立即测OD值（颜色转黄） | 15min内完成
四、结果计算与验证
1. 标准曲线绘制：
横坐标：标准品浓度（如2000~31.25 pg/ml）；纵坐标：平均OD450nm值（复孔）；
推荐四参数拟合（4PL） ：避免线性/半对数法的低值压缩误差（用Curve Expert或酶标仪自带软件）。
2. 浓度计算：
样本OD值代入曲线方程 → 浓度 × 稀释倍数；
校正读数：若酶标仪支持，用OD450nm OD570nm/630nm消除背景干扰。
五、关键注意事项
1. 样本处理：
避免溶血/脂血样本；
组织匀浆离心后上清若浑浊，需二次离心或过滤。
2. 操作细节：
全程更换吸头，分设试剂移液槽（防交叉污染）；
显色时间严格控制在20min内（过度显色导致假阳性）；
洗板后充分拍干，防止残留液体稀释试剂。
3. 试剂保存：
未开封试剂盒：20℃；开封后酶标板28℃干燥保存，其他组分按说明；
终止液（2M硫酸）按危险废弃物处理。
4. 质控要求：
批内/批间变异系数需＜10%/15%；
标准曲线R² ≥ 0.99。
六、常见问题解决
显色异常：
无色/弱色：检查酶标物活性、孵育温度；
全板深蓝色：洗板不充分或样本浓度过高（需稀释）。
标准曲线线性差：复溶不彻底或梯度稀释操作误差（涡旋混匀+离心）。
> 附：流程图摘要
> 样本处理 → 试剂平衡 → 标准品稀释 → 加样孵育 → 显色终止 → 读数计算
请以实际短链脂肪酸ELISA试剂盒包装内说明书为准，操作前务必阅读厂商提供的详细指南。
400-788-2680